Состав и аминокислотная последовательность

Состав и аминокислотная последовательность

При единообразно построенной полиамидной цепи специфичность пептидов и белков определяется двумя важнейшими характеристиками – аминоксилотным составом и аминокислотной последовательностью. Аминокислотный состав пептидов и белков – это природа и

количественное соотношение входящих в них -аминокислот.

Один из подходов к решению этой проблемы состоит в химическом гидролизе . Амидные связи могут гидролизоваться как в кислой, так и щелочной средах. Пептиды и белки гидролизуются с образованием либо более коротких цепей – это так называемый частичный гидролиз, либо

смеси -аминокислот при полном гидролизе. Щелочной гидролиз

практически не используется из-за неустойчивости многих -аминокислот в этих условиях. Полный гидролиз осуществляется при нагревании с 20%-ой хлороводородной кислотой до температуры 110 оС в течение 24 ч. в запаянной ампуле (в вакууме или атмосфере азота). В результате

образуется смесь -аминокислот. Аминокислотный состав устанавливают путем анализа пептидных и белковых гидролизатов чаще всего хроматографическими методами. В настоящее время такой анализ осуществляется с помощью аминокислотных анализаторов.

Другой путь – избирательный гидролиз, при котором от фрагмента отщепляют по одной аминокислоте на каждом этапе. Избирательный гидролиз (ферментативный гидролиз) чаще всего проводят с помощью ферментов из поджелудочной железы, так называемых карбоксипептидаз. Эти ферменты способны гидролизовать только С-концевые аминокислоты и, следовательно, постепенно разрушать пептидный фрагмент с С-конца. Нередко достаточно бывает проанализировать различные концентрации аминокислот полученных под действием карбоксипептидазы, которая гидролизовала фрагмент в течение постепенно возрастающих промежутков времени, чтобы получить необходимые данные относительно аминокислотной последовательности.

Первичная структура пептидов и белков – это аминокислотная

последовательность, т.е. порядок чередования, -аминокислотных остатков. Учитывая, что в составе белковой молекулы содержится как минимум несколько десятков аминокислотных остатков, определение местоположения каждого из них составляет весьма сложную задачу.

Первичная структура определяется путем последовательного отщепления -аминокислот с какого-либо конца и их идентификации. Довольно хорошо разработаны химические способы отщепления - аминокислот с N-конца.
Метод динитрофенилирования. Один из методов, используемых для идентификации NH2-концевых групп в полипептидах, основан на использовании реакции Сэнгера. Высокая нуклеофильность атома азота

-аминокислот позволяет проалкилировать его 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ, реактив Сэнгера). В этом соединении электрофильность бензольного ядра вследствие влияния двух сильных


62

электроноакцепторных нитрогрупп значительно повышена, что сильно увеличивает способность атома фтора вступать в реакцию замещения:

NO2 NO2 O O KOH

F


+ H2N-CH-C-NH- CH-C-...

-KF, -H2O

R
R1

ДНФБ полипептид
NO2 O O
NO2 HN-



CH-C-NH-CH-C-...



R R1
"меченный полипептид"
NO2 O
H

NO2 HN- CH-C-OH + Смесь -аминокислот


R
ДНФ-производное N-концевой
-аминокислоты

Образующееся динитрофенильное производное аминокислоты легко выделяется и идентифицируется хроматографически.

Метод Эдмана. Более удобный метод идентификации NH2-концевых аминокислот – это расщепление по методу Эдмана. Метод заключается во взаимодействии N-концевой -аминокислоты с фенилизотиоцианатом в щелочной среде.

Взаимодействие -аминокислот с фенилизоцианатом протекает по механизму нуклеофильного присоединения. В образовавшемся продукте далее осуществляется внутримолекулярная реакция нуклеофильного замещения, приводящая к образованию циклического замещенного амида.
..
C6H5-N=C=S + H2N-CH2-COOH

фенилизотиоцианат глицин








63

S

.. O H+ C
C6H5N NH

C6H5NH-C-NHCH2C OH -H2O C CH2
S
O
фенилтиогидантоин

Циклические соединения получаются с количественным выходом и представляют собой фенильные производные тиогидантоина, поэтому для них принято название фенилтиогидантоиновых производных (ФТГ-

производных) -аминокислот. ФТГ-производные различаются строением радикала R.

При дальнейшей обработке слабой кислотой без нагревания происходит отщепление от цепи «меченной» N -концевой ФТГ-аминокислоты. ФТГ-аминокислота идентифицируется методом тонкослойной или газожидкостной хроматографии.

Преимущество метода Эдмана состоит в том, что при отщеплении каждой концевой -аминокислоты остальная часть пептидной молекулы не разрушается и операции по отщеплению можно повторять.

Метод Эдмана оказался пригодным для воспроизведения в автоматическом приборе – секвенаторе (от англ. sequence – последовательность). При помощи этого прибора удалось расшифровать последовательность первых 60 аминокислотных остатков в миоглобине кита (начиная с NH2-конца полипептидной цепи).

Дансильный метод. Основан на получении производных N-концевой - аминокислоты при обработке дансилхлоридом (5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид) и последующем отщеплении при гидролизе разбавленной хлороводородной кислотой (105 оС, 12-16 ч).

Дансилпроизводные -аминокислот (ДНС-аминокислоты) обладают интенсивной флуоресценцией, позволяющей обнаружить их содержание даже в ничтожно малых количествах. Дансильный метод – один из самых высокочувствительных методов, так как для идентификации ДНС-аминокислот используется высокоэффективная жидкостная хроматография с флуоресцентным детектором.

По мере совершенствования экспериментальных методов и внедрения автоматических приборов быстро возрастает число пептидов и белков с установленной первичной структурой.








64

N(CH3)2 + H2N- O O




CH-C-NH-CH-C-...

SO2Cl R R1

полипептид
дансилхлорид

N(CH3)2

гидролиз

O O

SO2HN-CH-C-NH-CH-C-...
R R1
N(CH3)2

+ Смесь -аминокислот

O SO2HN-CH-C-OH

R

дансилпроизводное N-концевой -аминокислоты

Химические свойства пептидов и белков и особенно их биологические и физиологические функции зависят не только от числа и последовательности аминокислотных остатков в цепи, но и от конформации цепи в растворе. Поэтому для высокомолекулярных полипептидов и белков наряду с первичной структурой характерны более высокие уровни организации, которые принято называть вторичной, третичной и четвертичной структурами. Первые три уровня характерны для структурной организации всех белковых молекул. Четвертый уровень встречается при образовании единых белковых комплексов, состоящих из нескольких полипептидных цепей.

Конформации макромолекулы белка в растворе представляют собой различные ее пространственные формы, возникающие в результате поворотов отдельных молекулярных фрагментов вокруг одинарных связей. Они стабилизируются за счет межмолекулярных взаимодействий между отдельными группами данной макромолекулы или молекулами веществ, находящихся в окружающем растворе. Взаимные переходы



65

конформаций в основном осуществляются без разрыва ковалентных связей в макромолекуле белка.